Flow Cytometry

流式辅助试剂、工具

流式细胞技术分析的过程中,有很多因素会影响实验结果:样本的处理、荧光补偿的调节、Fc受体的阻断、活细胞和死细胞的鉴别等。

eBioscience公司提供流式染色缓冲液、细胞固定液、细胞破膜剂、细胞刺激剂、细胞阻断剂、FcR抗体、红细胞裂解液、细胞活性染料、细胞计数微球、荧光补偿微球等。为您的流式实验提供更稳定的结果。

 

流式Buffer

 

Intracellular Staining Buffer Selection

Antigen

Foxp3 Staining Buffer Set

Fixation & Permeabilization

HUMAN

 

 

 IFNy

 *

 YES

 IL-1a

 nt

 YES

 IL-1b

 nt

 YES

 IL-2

 nt

 YES

 IL-4 

 *

 YES

 IL-5 

 nt

 YES

 IL-6

 nt

 YES

 IL-9

 nt

 YES

 IL-10 

 *

 YES

 IL-12

 nt

 YES

 IL-13

 nt

 YES

 IL-17A

 YES

 YES

 IL-17F

 nt

 YES

 IL-21

 *

 YES

 IL-22

 *

 YES

 Granzyme B

 nt

 YES

 Perforin

 nt

 YES

 TNFalpha

 YES

 YES

 Eomes

 YES

 NO

 Foxp3

 YES

 NO

 Gata-3

 YES

 NO

 RORy(t)

 YES

 NO

 T-Bet

 YES

 NO

 

 

 

 MOUSE

 

 

 IFNy

 YES

 YES

 IL-1b

 nt

 YES

 IL-2

 YES

 YES

 IL-4

 *

 YES

 IL-6

 nt

 YES

 IL-10

 *

 YES

 IL-17A

 YES

 YES

 IL-17F

 YES

 YES

 IL-21

 NO

 YES

 IL-22

 *

 YES

 Granzyme B

 YES

 YES

 Perforin

 YES

 YES

 TNFalpha

 YES

 YES

 Eomes

 YES

 NO

 Foxp3

 YES

 NO

 Gata-3

 YES

 NO

 Nanog

 YES

 NO

 Oct 3/4

 YES

 NO

 RORy(t)

 YES

 NO

 T-Bet

 YES

 NO

nt = Not tested

YES = Staining compatible with this buffer system

NO = Staining not compatible with this buffer system

*Staining is possible with the Foxp3 Staining Buffer Set, although in some cases a reduction in brightness has been observed. No change in the percentage of positive cells has been observed.

 

 Target

 Clone

IC fix/perm

 Foxp3

 IC fix/methanol

 pSTAT1 (Y701)

 KIKSI0803

-

 -

 +++

 pSTAT4 (Y693)

 4LURPIE

-

 -

 +++

 pSTAT5 (Y694)

 SRBCZX

-

 -

 +++

 pSTAT6 (Y641)

 CHI2S4N

-

 -

 +++

 pSrc (Y418)

 SC1T2M3

 ++

 ++

 +++

 pZAP-70/SYK Y319/Y352

 n3kobu5

 ++

 ++

 +++

 pSYK (Y348)

 moch1ct

 ++

 ++

 +++

 pBTK/ITK (Y551/Y511)

 M4G3LN

 ++

 ++

 +++

 pERK1/2 (T202/Y204)

 MILAN8R

-

  -

 +++

 pNFkB p65 (S529)

 B33B4WP

 +++

  -

 +++

 pS6 (Y235/Y236)

 cupk43k

 +++

  ++

 +++

 pH2AX (S139)

 CR55T33

-

  +++

 +++

 

 

 

细胞刺激/阻断剂

 

细胞刺激:未活化的细胞所分泌的细胞因子很少,用流式细胞术很难检测出来,因此在检测前需要刺激淋巴细胞使其活化。eBioscience提供多种细胞刺激物:ConA、LPS、PMA、PHA-L 

 

细胞因子转运抑制剂:

 

细胞在活化后,分泌的细胞因子会转运到细胞外。流式检测只能对细胞表面或细胞内部的抗原进行检测,因此必须阻止细胞因子分泌到细胞外,使其聚集在细胞内。常用的阻断剂有BFA和Monensin。

 

Mouse Cytokines: Intracellular Staining Quick Guide

Mouse Cytokine

Cell Source

Activation

Incubation Time

Restimulation

Intracellular Block

Antibody

GM-CSF

mouse spleen

ConA (3ug/mL) (2d)/IL-2 (20ng/mL)+IL-4 (20ng/mL) (3d)

2d/3d

anti-CD3 (10ug/mL immobilized) + anti-CD28 (2ug/mL soluble) 5hr

Brefeldin A

MP1-22E9

IFN-gamma

mouse spleen

ConA (3ug/mL) (2d)/IL-2 (20ng/mL)+IL-4 (20ng/mL) (3d)

2d/3d

anti-CD3 (10ug/mL immobilized) + anti-CD28 (2ug/mL soluble) 5hr

Brefeldin A

XMG1.2

IL-1 alpha

mouse PEC

mIFNγ (100ng/mL) (2hr)/LPS (100ng/mL)(22hr)

2hr/22hr

-

Brefeldin A

ALF-161

IL-1 beta

mouse PEC 

LPS (100 ng/mL) (22hr)

22hr

-

Monensin

NJTEN3

IL-2

mouse spleen

ConA (3ug/mL) (2d)/IL-2 (20ng/mL)+IL-4 (20ng/mL) (3d)

2d/3d

anti-CD3 (10ug/mL immobilized) + anti-CD28 (2ug/mL soluble) 5hr

Brefeldin A

JES6-5H4

IL-4

mouse spleen

Th2 polarized

6d

PMA (50 ng/mL) + Ionomycin (1 ug/mL) 5hr

Brefeldin A

BVD6-24G2,
11B11 

IL-5

mouse splenic CD4

ConA (3ug/mL) (2d)/IL-2 (20ng/mL)+IL-4 (20ng/mL) (3d)

2d/3d

immobilized) + anti-CD28 (2ug/mL soluble) 5hr

Brefeldin A

TRFK5

IL-6

mouse PEC

LPS (100 ng/mL) (22hr)

22hr

-

Monensin

MP5-20F3

IL-10

mouse spleen

ConA (3ug/mL) (2d)/IL-2 (20ng/mL)+IL-4 (20ng/mL) (3d)

2d/3d

anti-CD3 (10ug/mL immobilized) + anti-CD28 (2ug/mL soluble) 5hr

Brefeldin A

JES5-16E3,
JES5-2A5 

IL-12/IL-23 (p40)

mouse PEC

LPS (100 ng/mL) (22hr)

22hr

-

Brefeldin A

C17.8

IL-13

mouse spleen

Th2 polarized

6d

PMA (50 ng/mL) + Ionomycin (1 ug/mL) 5hr

Brefeldin A

eBio13A

IL-17A

mouse spleen

Th17 polarized

6d

PMA (50 ng/mL) + Ionomycin (1 ug/mL) 5hr

Monensin

eBio17B7

IL-17F

mouse spleen

Th17 polarized

6d

PMA (50 ng/mL) + Ionomycin (1 ug/mL) 5hr

Monensin

eBio18F10 

IL-21

mouse spleen

Th17 polarized

9d

PMA (50 ng/mL) + Ionomycin (1 ug/mL) 5hr

Monensin

FFA21

IL-22

mouse spleen

Th17 polarized

12d

PMA (50 ng/mL) + Ionomycin (1 ug/mL) 5hr

Brefeldin A

IL22JOP

IL-23 p19

mouse bone marrow

mGM-CSF (40 ng/mL)

8d

LPS (1 ug/mL) (24 hr)

Monensin

fc23cpg

MCP-1/ CCL2

mouse PEC

LPS (100 ng/mL) (24hr)

24hr

-

Brefeldin A

2H5

TNF alpha

mouse spleen

ConA (3ug/mL) (2d)/IL-2 (20ng/mL)+IL-4 (20ng/mL) (3d)

2d/3d

anti-CD3 (10ug/mL immobilized) + anti-CD28 (2ug/mL soluble) 5hr

Brefeldin A

MP6-XT22,
TN3-19 

Annotations: mouse PEC=mouse thioglycolate-elicited peritoneal macrophages; ConA=Concanavalin A; Iono=Ionomycin; LPS=Lipopolysaccharide; PMA=Phorbol Myristate Acetate; 2d=2 day culture; 5hr=5 hour culture

Human Cytokines: Intracellular Staining Quick Guide

Human Cytokine

Cell Source

Activation

Incubation Time

Restimulation

Intracellular Block

Antibody

G-CSF

PBMC

LPS (1 ug/mL)

24hr

-

Monensin

8F5CSF

GM-CSF

PBMC

PMA (30-50ng/mL)/Iono (1ug/mL)

5hr

-

Monensin

BVD2-21C11

IFN gamma

PBMC

PMA (30-50ng/mL)/Iono (1ug/mL)

5hr

-

Brefeldin A

4S.B3

IL-1 alpha

PBMC

LPS (1 ug/mL)

24hr

-

Monensin

364/3B3-14, CRM8

IL-1 beta

PBMC

LPS (100ng/mL)

4hr

-

Brefeldin A

CRM56

IL-1RA

PBMC

LPS (100ng/mL)

24hr

-

Brefeldin A

CRM17

IL-2

PBMC

PMA (30-50ng/mL)/Iono (1ug/mL)

4-6hr

-

Brefeldin A

MQ1-17H12

IL-4

PBMC

PMA (30-50ng/mL)/Iono (1ug/mL)

4-6hr

-

Brefeldin A

8D4-8

IL-5

CD4

Th2 polarizing cultures

6d 

PMA (50ng/mL) + Ionomycin (1ug/mL) (5hr)

Brefeldin A

TRFK5, JES1-5A10

IL-6

PBMC

LPS (100ng/mL)

24hr

-

Brefeldin A

MQ2-13A5

IL-9

CD4

Th2 polarizing cultures

6d

PMA (50ng/mL) + Ionomycin (1ug/mL) (5hr)

Monensin

MH9A4

IL-10

CD4

Th2 polarizing cultures

6d

PMA (50ng/ml) + Ionomycin (1ug/ml) (5hr)

Monensin

JES3-9D7

IL-12/ IL-23 (p40)

PBMC

hIFN gamma (100ng/mL) (2hr)/LPS (100ng/mL) (22hr)

2hr/22hr

-

Brefeldin A

C8.6

IL-13

CD4

anti-CD3 (10ug/mL, immobilized) + anti-CD28 (2ug/mL, soluble) + IL-2 (10ng/mL) + IL-4 (20ng/mL) (2d); IL-2 (10ng/mL) + IL-4 (20ng/mL) (3d)

2d/3d

PMA (5ng/ml) + Ionomycin (500ng/ml) (4hr)

Brefeldin A

PVM13-1

IL-17A

PBMC

Th17 polarizing cultures

6d

PMA (50ng/ml) + Ionomycin (1ug/ml) (5hr)

Brefeldin A

eBio64CAP17,

eBio64DEC17

IL-21

PBMC

PMA (30-50ng/mL)/Iono (1ug/mL)

4-7hr or 12-18hr

-

Brefeldin A

eBio3A3-N2

IL-22

CD4

Th17 polarizing cultures

6d

PMA (50ng/ml) + Ionomycin (1ug/ml) (5hr)

Brefeldin A

IL22JOP

IL-23 p19

PBMC

hGM-CSF (40ng/mL) +hIL-4 (40ng/mL)

6d

LPS (1ug/mL) (24hr)

Monensin

23dcdp

MCP-1/ CCL2

PBMC

LPS (1ug/mL)

24hr

-

Monensin

2H5,

5D3-F7

RANTES/ CCL5

PBMC

LPS (1ug/mL)

24hr

-

Monensin

VL1

TNF alpha

PBMC

PMA (30-50ng/mL)/Iono (1ug/mL)

5hr

-

Brefeldin A

MAb11

TNF beta

PBMC

Th1 polarizing cultures

6d

PMA (50ng/mL) + Ionomycin (1ug/mL) (5hr)

Monensin

359-81-11

Annotations: Iono=Ionomycin; PMA=Phorbol Myristate Acetate; LPS=Lipopolysaccharide; 2d=2 day culture; 5hr=5 hour culture; LPS for activation of human PBMC obtained from Sigma (#L-8274)

 

Non-Cytokine Proteins: Intracellular Staining Quick Guide

Antigen

Antibody

Mouse/Rat Bcl-2

10C4

Mouse CTLA-4 (CD152)

UC10-4B9

Human CTLA-4 (CD152)

14D3

Human/Mouse/Rat Cytochrome C

6H2

Human Foxp3

PCH101

Mouse Foxp3

FJK-16s

GATA3

 

Mouse/Human Granzyme B

eBioGrB

House Langerin (CD207)

eBioRMUL.2

Human Nanog

hNanog.1

Human PCNA (Proliferatin Cell Nuclear Antigen)

PC10

Mouse Perforin

eBioOMAK-D

Human Perforin

dG9

ROR gamma

 

Mouse SLP-76

MS76

Human SLP-76

HS76

Human/Mouse T-bet

eBio4B10 (4B10, 4-B10)

Human TLR3

TLR3.7

Mouse TLR9

M9.D6

Human TLR9

eB72-1665

Mouse/Human ZAP-70

1E7.2

Fc受体阻断剂 

Fc受体是指细胞膜表面能与免疫球蛋白(IgGIgAIgMIgEIgDFc片段结合的受体。目前已鉴定明确属于CD抗原的Fc受体有FcγRCD64CD32CD16)、FcαRFcεRFcR能够与抗体的Fc段结合,在检测时产生假阳性。 使用FcR阻断剂,可以消除假阳性,降低检测背景,获得更清晰的结果。其广泛存在于NK细胞、肥大细胞、巨噬细胞、中性粒细胞的表面。

用Mouse IgG2a Isotype Control FITC (cat.11-4724) (左图) or Mouse IgG2bIsotype Control FITC (cat. 11-4732) (右图)染U937细胞,没有用Human Fc gamma R-Binding Inhibitor预处理的是紫色底纹,用Human Fcgamma R-Binding Inhibitor预处理的是蓝线,红线是U937细胞自发荧光。

 

细胞计数:123count eBeads ™

 

² 在流式平台上计数细胞

² 利用抗体标记细胞并利用123count eBeads计算该细胞群数量

² 可同时并用FVD细胞存活染料标记活细胞计数

 

应用领域

² 全血细胞计数

² 流式细胞仪计数功能验证

² 精子浓度计数

² 可并用细胞存活染料7-AADPIFVD计数细胞存活率

² 使用磁珠细胞分选试剂盒后计算细胞分选产率与纯度

 

123counteBeads 使用方式



  • 加入123count eBeads TM

  • 选定待计数的细胞

  • 公式计算细胞浓度

 

² 加入 * 已知浓度的123count eBeads 进未知浓度的细胞样本

² 流式细胞仪同时读取细胞与123count eBeads

² 公式计算细胞浓度如下

 

1. 当细胞与123count eBeads 体积比为1:1混合时

实际细胞数=流式细胞仪显示细胞数量÷流式细胞仪显示eBead数量× eBead 标示浓度

 

2. 如混合体积比不是1:1时

实际细胞数=(流式细胞仪显示细胞数量 X eBead体积)÷(流式细胞仪显示eBead数量 X 细胞体积)X eBead 标示浓度

 

*每管123count eBeads TM 标示有该管内eBead的浓度



全血CD4实际细胞计数示范

= (流式细胞仪显示细胞数量/流式细胞仪显示eBead数量) X eBead标示浓度

= (541个细胞/1009 eBeads) X 998 eBeads/ul

= 535个细胞/ul

 

调节荧光补偿的利器——荧光补偿微球

eBioscience抗体捕获微珠是球状的,可以和荧光抗体结合,作为流式实验的补偿对照。

抗体捕获微珠分为阳性和阴性,阳性微珠能捕获所有的小鼠、大鼠或仓鼠抗体,阴性微珠不会和抗体反应。当荧光共轭抗体加到微珠上,就可以区分出阴阳性微珠,阳性微珠可以作为多色流式实验的单色补偿对照。

 

优点:

  • 通常荧光都比样本表达要强

  • CV值小,几乎没有背景荧光

  • 和你实际染色的荧光抗体结合

  • 不需要使用珍贵的样本

  • 使用简单

 

OneCompeBeads和小鼠、大鼠、仓鼠的免疫球蛋白轻链反应,对488nm蓝色,532nm绿色,561nm黄绿色和633 - 640 nm红色激光所激发的荧光染料的光谱进行补偿。可兼容eFluor® 450,但是对405 nm紫色激发的光谱不能很好的补偿。

 

UltraComp eBeads和小鼠、大鼠、仓鼠的免疫球蛋白轻链反应,能对355nm紫外,405nm紫色,488nm蓝色,532nm绿色,561nm黄绿色和633 - 640 nm红色激光所激发的荧光染料的光谱进行补偿。

将流式常用的13种不同的PE(见左图),eFluor450(见右图)共轭单克隆抗体和UltraComp eBeads混匀,Beads捕获0.25 ug抗体后上流式细胞仪分析,每个直方图代表一种染色抗体(图右边是克隆和同型)。

 

 

实验所需材料:

12x75 mm 圆底试管

直标抗体

流式染色缓冲液 (eBioscience Cat. No.00-4222)

 

实验操作流程:

准备单色补偿对照

1、 每种荧光染料标记一个管。

2、 微珠通过反复颠倒或涡旋混匀,混匀时间不低于10min

3、 每个管里加一滴UltraComp eBeads

4、 每个管里加少量共轭抗体。

5、 用移液枪吸打或涡旋短暂混匀。

6、 2-8℃避光孵育15-30min。

7、 每管加2mL流式染色缓冲液后400-600 ×g离心3-5min。

8、 弃去上清液,加0.2-0.4mL流式染色缓冲液。

9、 分析前用移液枪抽打或涡旋短暂混匀。

Share:
Back