Foxp3 染色过程　　

下面是人的Foxp3用结合Foxp3抗体（例如 PCH或者236A/E7克隆）的荧光染料进行胞内染色的过程。请参照相应的特异性克隆过程。小鼠或者大鼠组织的染色在用固定/透化液孵育过程时可能会稍 微改动一下。Foxp3染色缓冲液的使用是很关键的。　　在染色之前，应该把固定/透化浓缩液按1:3的比例稀释，此缓冲液的储存时间不能超过一天。例 如，12 份样品，用3 ml固定/透化浓缩液和9 ml固定/透化稀释液。在使用之前，10×透化浓缩液应该稀释为1×溶液

1． 加100 ?l 准备好的细胞（1×106个/?l）加入到各个试管中；

2． 染色表面分子如CD4、CD8、CD25等，这个网站是表面染色过程（http://www.ebioscience.com/ebioscience/appls/FCS.htm）.

3． 用冷的流式液或冷的PBS洗涤；

4． 斡旋重悬细胞并且在每一个样品中加入1 ml 新鲜的固定、透化液。再次涡旋。

5． 4 ℃避光孵育30-60 min；

6． 加入2 ml 1×透化液洗涤一次，然后离心沉淀并倒掉上清液；

7． 用100?l 2% 正常鼠的血清4 ℃封闭15分钟；

8． 封闭后不用洗，加入20 ?l 结合Foxp3抗体的荧光染料或者同种对照，4 ℃避光孵育至少30min；

9． 加入2 ml 1×透化液洗涤，离心沉淀弃掉上清；

10． 重复步骤9；

11． 用适当的流式染料缓冲液重悬细胞，然后再流式细胞仪上分析。请注意由于固定和透化过程，细胞数量的FSC/SSC分布将和活细胞不同。因此门和电位差将会被修改。