实验材料：

　　Mouse, Rabbit 或Goat IgG TrueBlot™

　　TrueBlot™ Ig IP 微球 or Protein A 或 G 微球

　

实验设备：

　　SDS-PAGE电泳及转膜相关设备和缓冲液；

　　微量移液器；

　　摇床；

　　PVDF或nitrocellulose膜；

　　WB结果检测设备及底物

实验步骤

　　1）. 免疫共沉淀（IP）和SDS-PAGE电泳

　　(1) 细胞裂解：往10⁷/ml细胞中加入适量预冷的细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，混匀4度孵育30-60分钟后10000g离心15min，保留上清液。布氏法检测蛋白浓度后，将样品稀释为1μg/μl左右。可-80度冻存或继续下一步。

　　(2) 细胞裂解物的预清洗：加50ul之前用裂解液稀释的相应种属Ig IP Beads（or Protein A/G beads）到装有500ul细胞裂解物的离心管中，冰上孵育30-60分钟；2500×g离心2-3分钟后把上清液（不能带沉淀微球）转移到新的离心管中。

　　(3) 免疫共沉淀：在装有预清洗后的细胞裂解物的离心管中加入1-10ug的一抗，4°C孵育 1-2小时或者摇晃过夜。再加入50ul用裂解液预处理过的Ig IP Beads（or Protein A/G beads），4°C混匀孵育1-2小时或摇床过夜后2500×g离心0.5分钟（可以和一抗一起孵育）。尽量完全地移去上清液并用500ul预冷的裂解液洗涤3次（每次都要离心弃完上清，有利于降低背景）。

　　(4) 最后一次洗涤并小心的吸掉上清液后，加入50ul 1X Laemmli sample buffer（或含50mM DTT的SDS Sample Loading Buffer）（注意Sample Loading Buffer成分必须含有还原剂）。Vortex混匀后加热至90-100℃，10分钟。10000×g离心5分钟，小心收集上清。10-30ul上样电泳，避免上样Beads。

　　注：收集的上清液可以置于-20°C保存。用时解冻后，加入新鲜的DTT并加热至90-100℃十分钟。10000×g离心5分钟，收集上清进行上样电泳。

　　2）. 免疫印迹（Western Blotting）

　　(1) 如前所述SDS-PAGE电泳结束。

　　(2) 把蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至NC膜上。丽春红-S染色鉴定是否转膜成功，考马斯亮蓝对SDS-PAGE进行染色分析转膜效率，蒸馏水或TBST清洗丽春红。

　　(3) 在通风柜里，将NC膜在True Blot enhancer buffer 浸泡2min，TBST清洗一次。

　　(4) 将NC膜浸入5%的脱脂奶粉的封闭液中，置于摇床上室温封闭2小时。

　　(5) 弃去封闭液后，加入靶蛋白一抗（用5%脱脂奶粉封闭液稀释，终浓度需要预实验摸索，建议1-2ug/ml）。置于摇床上室温孵育2小时或者4℃孵育过夜。

　　(6) 用TBST洗涤膜4-5次，每次5-10分钟。

　　(7) 弃去洗液后加入适量的用5%脱脂奶粉封闭液稀释好的TrueBlot™（稀释比为1：1000），室温孵育1小时。

　　(8) 用PBST或TBST洗涤膜4-5次，每次5-10分钟。

　　(9) 用合适的过氧化物酶HRP化学发光底物并按照说明（等量的底物A+底物B）进行显色反应。

　　(10) 在暗室中用X光片曝光，根据结果调整曝光时间（10sec、1min、5min和20min）和曝光区域,以得到最佳效果。

　　3）. 注意事项

　　(1) 免疫共沉淀抗体的稀释：用于免疫共沉淀的抗体在使用之前需要进行稀释，例如使用浓度为1-5ug/10⁷细胞/ml。一般对于从10⁷细胞裂解出的大部分蛋白抗原来说，加入2ug抗体就足够了。因为尽量减少抗体用量可以降低还原性沉淀抗体对SDS-PAGE电泳样品检测的干扰。（TrueBlot™并不能增强免疫印迹中抗体和抗原之间的特异性结合，所以如果用于WB的抗体能与非目的蛋白产生交叉反应，结果也会被TrueBlot™检测出来）

　　(2) WB的封闭：Mouse, Rabbit 和Goat IgG TrueBlot™检测过程中的膜封闭，一抗稀释孵育和TrueBlot™稀释孵育过程都建议使用5%（w/v）的脱脂奶粉液。BSA不建议使用于此过程。

　　(3) 阳性对照：Mouse, Rabbit 和Goat IgG TrueBlot™检测SDS-denatured, non-reduced mouse IgG，所以可用20ng non-reduced沉淀抗体直接上样电泳，然后WB作为IgG TrueBlot™的阳性对照。

　　(4) 阴性对照：WB过程中不加一抗，直接加二抗TrueBlot™ beads。

　　(5) SDS-PAGE电泳及WB：Mouse, Rabbit 和Goat IgG TrueBlot™检测过程为用含适量抗氧化剂上样液电泳，然后Poncean S预染和20%的乙酸/30%甲醇脱色；再室温自然晾干1小时，用含甲醇的Buffer A润膜后封闭。这个操作过程可以得到很好的WB结果，PVDF膜或硝酸纤维膜都适用于此检测过程。

　　4）.相关缓冲液配方：

　　2X SDS Reducing Sample Loading Buffer (包含50 mM DTT)

　　950 mL 2X SDS sample buffer

　　50 mL 1M DTT

　　注: 1小时内使用，过期丢弃。.

　　2X SDS Sample Buffer

　　6% SDS

　　25mM Tris base pHed to 6.5 with HCl

　　10% glycerol

　　Bromphenol blue

　　注: -20°C长时间储存 ，室温最多只能储存一月。

　　TBS-Tween (TBS-T):

　　25 mM Tris-HCl, pH 8.0

　　125 mM NaCl

　　0.1% Tween 20

　　Blocking Buffer:

　　5g 脱脂奶粉

　　100ml TBS-T

　　调整PH值为7.4

　　Antibody Binding Buffer:

　　 含1% 脱脂奶粉 TBS-T

　　Protease Inhibitor Cocktail (100X):

　　PMSF, 5mg (50μg/ml)

　　Aprotinin, 100μg (1μg/ml)

　　Leupeptin, 100μg (1μg/ml)

　　Pepstatin, 100μg (1μg/ml)

　　Phosphatase Inhibitor (100X):

　　1mM Na3VO4

　　1mM NaF

　　注： IP: Immunoprecitaton免疫共沉淀. WB: Western Blot蛋白质印记

参考文献：

1. Alegria-Schaffer A, Lodge A, Vattem K. 2009. Performing and optimizing Western blots with an emphasis on chemiluminescent detection. Methods Enzymol. 2009;463:573-99.

2. Haan C, Behrmann I. 2007. A cost effective non-commercial ECL-solution for Western blot detections yielding strong signals and low background. J Immunol Methods. Jan 10;318(1-2):11-9.

3. Immunoblot affinity purification. 2005. Nature Methods 2, 797 – 798.

4. Uhlig U, Uhlig S, Branscheid D, Zabel P, Vollmer E, Goldmann T. 2004. HOPE technique enables Western blot analysis from paraffin-embedded tissues. Pathol Res Pract. 2004;200(6):469-72.

5. Wu M, Stockley PG, Martin WJ 2nd. 2002. An improved western blotting technique effectively reduces background. Electrophoresis. Aug;23(15):2373-6.