ELISA

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ELISA Ready Set Go标准实验方案

注意:
1.试验中使用特定试剂盒的标准品和抗体,不建议不同试剂盒产品调换,因为可能影响结果准确性。
2.标准曲线孔建议做2-3个复孔。
3.稀释用的缓冲液中不能含有叠氮化钠,因为其可以灭活辣根过氧化物酶。

标准品稀释(如下图)
1.按照C of A说明使用检测稀释液配制浓度为500pg/ml 的标准品溶液。
2.在高亲和ELISA板子中从B1和B2开始到H1和H2每孔分别加入100ul检测稀释液。
3.取200ul的浓度为500pg/ml的标准品加入到A1和A2两个孔中。
4.用排枪从A1和A2两个孔中吸取100ul加入到对应的B1和B2中,吹吸混合均匀,那么 B1和B2标准品浓度为250pg/ml。
5.从B1和B2中吸取100ul加入到C1和C2孔中,混匀,那么C1和C2孔标准品浓度为125pg/ml。
6.按照步骤4和5的方法倍比稀释到H1和H2两孔。H1和H2孔中标准品的浓度是4pg/ml,体积为200ul,取100ul弃掉。届时每个孔标准品的体积均为100ul。
注意:4到6步骤稀释速度要快,避免时间过长,建议使用多通道排枪进行。
7.设置A3和A4为空白对照(只加100ul稀释液),为了避免胡克效应的影响,我们建议可以采用A1和A12作为空白对照孔,而不设置样品或标准品。

结果计算:(需要从标准品OD值拟合出来方程来推算样品的细胞因子的含量)。
1.计算标准品,空白和样品孔平均OD值。
2.样品OD值减去空白孔平均OD值。
3.利用软件拟合出4参数的对数标准曲线,也可以使用描点的方法在坐标中描绘出X轴为标准品浓度,Y轴为平均OD值的各个点,然后大致拟合出相应的曲线。最佳的方法是使用回归分析的方法拟合出标准曲线。
4.利用标准曲线拟合的公式去计算样品中细胞因子的浓度。
5.如果在实验前样品经过稀释,则结果需要乘于稀释倍数。

储存和稳定性说明
1.EB的ELISA试剂盒若按照说明书储存保质期为6个月。
2.试剂盒提供冻结的标准品20ul/瓶,收到后请立即冻存与-80度冰箱,可保存6个月;使用时融化离心1分钟,可避免标准品损失。请避免将标准品分装和反复冻融。每瓶标准品只能用一次,剩余失效。稀释标准品步骤请参照说明书第一部分。
3.ELISA板子请室温储存,其他试剂4度储存即可。

实验材料:

功能纯化级别的捕获抗体。
结合生物素的检测抗体。
标准品。
10×ELISA包被缓冲液。
5×检测稀释液。
抗生物素的辣根过氧化物酶。
TMB底物。
高亲和力96孔板(NUNC Maxisorp flat-bottom or Corning Costar 9018)。
1×PBS+0.05%吐温20(或者ELISA洗液 Cat.No. 00-0400)
终止液:1M H3PO4 或者2N H2SO4

仪器

吸管和单通或多通移液器
冰箱
排枪水槽
分光光度计
洗板机

实验流程:

1.使用无菌水将包被液稀释为1×(注意:预先将包被液平衡至室温)。
2.用1×包被液稀释功能级别的包被抗体,包被ELISA板子,每孔100ul,盖板,四度孵育过夜。
3.第二天稀释检测稀释液(双蒸水稀释),吸出板子的捕获抗体溶液,用300ul洗液洗板3-5次,每次浸泡时间不小于1min,吸水纸上排干。
4.200ul检测稀释液封闭板子,盖板,室温孵育1小时。
5.吸去检测稀释液,用300ul洗液洗板3-4次,每次浸泡时间不小于1min,吸水纸上排干。
6.按照上述说明使用1×检测稀释液稀释标准品(严格按照说明书进行)。
7.加100ul样品和标准品到对应的孔中,封板,室温孵育2个小时或4度过夜(高灵敏度)。
8.孵育期间,按照说明书准备检测抗体。
9.吸去样品,用300ul洗液洗板5次,每次浸泡时间不小于1min,吸水纸上排干。
10.每孔加100ul检测抗体,封板,室温孵育1个小时。
11.孵育期间,按照说明书准备抗生物素的HRP溶液。
12.每孔加100ul抗生物素的HRP溶液,封板,室温孵育0.5个小时(避免溶液中有叠氮钠,因为会影响HRP活性)。
13.吸去溶液,用300ul洗液洗板3-4次,每次浸泡时间不小于1min,吸水纸上排干。
14.每孔加100ulTMB溶液,封板,室温孵育15min(注意:TMB要预先平衡至室温)。
15.加50ul终止液终止。
16.加终止液后30min内检测,450nm读板。

附录:缓冲液配制方法

1X PBS:
 80.0 g NaCl
 11.6 g Na2HPO3
 2.0 g KH2PO4
 2.0 g KCl
 以 1 L DI H2O定容 并调节 pH 值为 7.0

ELISA Wash Buffer:
 1 L 的1X PBS
 0.5 mL Tween-20
 此外, 也可以购买ELISA洗液干粉 (eBio cat. # 00-0400) ,用1 L DI H2O重悬。

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