WB实验常见问题

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  • 为什么实际的蛋白质印迹条带大小与预期的不同?
  • 蛋白质印迹是根据大小分离蛋白质的技术。通常,分子量越小的蛋白质在凝胶中的迁移速率越快。但是迁移速率也受其他因素影响,因此观察到的实际条带大小与预期的可能会有差别。常见因素包括:

    1. 翻译后修饰 - 例如磷酸化、糖基化等,这些修饰会增加蛋白质的分子量。
    2. 翻译后剪切 - 例如,很多蛋白质首先合成为前体蛋白,然后剪切形成活性形式,例如半胱天冬酶前体
    3. 剪接变体 - 通过选择性剪接,可实现同一基因产生不同大小的蛋白质
    4. 相对电荷 -氨基酸的组成(带电荷的氨基酸与未带电荷的氨基酸各自所占的比例)
    5. 多聚体 - 例如,蛋白质二聚体。蛋白之间强烈的相互作用会造成条带偏大,但采用还原条件通常可以避免多聚体的形成。
  • 转膜后经丽春红染色的条带,为什么大蛋白分子的一端的转膜不是很好?
  • 这是正常的,大分子的蛋白转移的慢,如果延长转移时间和电流,大分子一端就会好的多,但是小分子的一端可能就会变淡。

  • 大蛋白和小蛋白转膜时要注意哪些?
  • 对于大蛋白(大于100kDa)而言,其在凝胶电泳分离迁移较慢,而从凝胶转出也非常慢,因此对于这种大分子量蛋白应该用低浓度的凝胶,8%或更低,但因低浓度的胶非常易碎,所以操作时需十分小心;SDS阻止蛋白与膜的结合,小蛋白更是如此。因此,对于小分子的蛋白,电转移缓冲液中可不加SDS,同时保持20%的甲醇浓度。

  • western blot 使用的膜哪种好,PVDF好还是NC膜,如何选择?
  • PVDF膜价格较贵,可重复使用,特别适合蛋白印迹,结合能力较强,但价格比较昂贵。 NC膜价格比较便宜,应用较广,结合牢固性差一些,韧性也不如PVDF,不能重复使用,但蛋白吸附容量高,亲水性较好。 都可以用丽春红染色。具体使用还要参考相关文献。

  • western用的一抗,单抗好些还是用多抗好些?
  • 一般来说单抗的特异性好,杂带少;多抗相对单抗易出条带,但特异性较差,可能会出现高背景和多带现象。

  • 制备蛋白样品时,应选择哪种裂解缓冲液来释放目的蛋白?
  • 裂解缓冲液有很多种,但用来做WB实验的仅有少数几种,简单来说,它们溶解蛋白的能力不同,含有十二烷基硫酸钠和其他离子型去污剂的溶解能力最强。

    样品类型

    裂解液

    全细胞

    NP-40或RIPA

    细胞质(可溶性的)

    Tris-HCl

    细胞质(细胞骨架)

    Tris-Triton

    膜结合部分

    NP-40或RIPA

    细胞核

    RIPA或核裂解液

    线粒体

    RIPA或线粒体分离方案