流式细胞术

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如何选择合适的荧光

  • 必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发

  • 激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围内

  • 荧光染料光谱的重叠应当尽量减少

  • 高表达量的抗原几乎可以用任何荧光染料标记抗体检测,而较低表达的抗原则需要用较高S/N比值的荧光染料标记的抗体检测。常用荧光的强弱如下:PE>APC>PE-Cy7>Percy-Cy5.5>FITC>APC-Cy7

  • 检测自发荧光水平高的细胞时,使用发射光波长较长的荧光染料(如APC),可以得到较好的S/N比值。

     

 

根据仪器选用荧光染料:

1、每个人通道只能选择一种荧光染料;

2、各个通道之间的荧光染料可以随意搭配,搭配的荧光染料之间发射光谱重叠尽量小。

激发光波长

通道

荧光染料

488nm

FL1

FITC\GFP\Alexa Fluar488\Bidipy\Fluo-3

FL2

PE\Propidium Iodide(PI)

FL3

PerCP\ PerCP-Cy5.5\PE-Cy5\PE-Cy5.5\PE-Teses Red\7-AAD

FL4

PE-Cy7\PE-Alexa Flour750

633nm

FL5

APC\Cy5\Alexa Fluor647\Alexa Fluor660\ Alexa Fluor700

FL6

APC-Cy7\APC-Alexa Flour750

375nm

FL7

Hoechsr33342-Blue\DAPI

FL8

Hoechsr33342-Red

405nm

FL9

Parific Blue\Cascade Blue\Alexa Flour 405

FL10

Parific orange

 

不同的流式细胞仪可选的荧光染料 

 

 

做多色实验,使用荧光染料多,可以登陆eBioscience网站http://www.ebioscience.com/resources/fluorplan-spectra-viewer.htm,借助FluorPlanSpectra Viewer 进行荧染料光选择,减少荧光叠加现象,便于后期数据分析。

 

荧光补偿

  • 荧光溢漏:当一个荧光经过激光之后,激发发射光及发射波长,而各个荧光发射光之间有一定的重叠,会溢漏一部分的荧光到其他邻近的通道里。

  • 荧光补偿:如果我们要检测一个通道的信号的时候必须要将其他通道溢漏过来的光减掉,才能检测到目标通道的真正信号,而这个纠正荧光溢漏的过程就是我们所说的荧光补偿。

  • 荧光补偿和荧光染料本身的特质有关,和PMT有关。为了减少溢漏值,可以增加主通道的PMT电压,或者减少被溢漏通道的PMT电压。

 

 

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