新冠肺炎

研究COVID-19时不要忘记T细胞和记忆B细胞

抗体效价与T细胞反应可能呈负相关

      免疫反应是由先天免疫细胞和适应性免疫细胞的复杂相互作用所完成的，重要的是，抗体和B细胞反应本身并不能提供全部情况。

      抗体效价是否是抗SARS-CoV-2保护性免疫的标志物目前还存在争议（更多信息请参阅世卫组织网站）。T辅助细胞和细胞毒性T细胞诱导的细胞免疫在发展保护性免疫中起着重要作用，并且不应忘记对T细胞的免疫监测。

      我们在一项小规模的试点研究中使用FluoroSpot分析了7名COVID-19康复患者。使用FluoroSpot，可以在直接用病毒肽重新刺激后，以高灵敏度（比流式细胞仪高数百倍）分析细胞因子的分泌。我们选择IL-2作为IFN-γ的附加分析物，因为与单独使用IFN-γ相比，该组合提供了对T细胞对病毒感染反应的更全面的评估（Chauvat等人，Hum Vaccin Immunother，2014）。同时，我们使用内部开发的SARS-CoV-2 ELISA观察了相同个体的抗体（IgG）水平，并将其与FluoroSpot数据进行了比较。

SARS-CoV-2特异T细胞的数量与抗体效价负相关

先前经PCR确认为SARS-CoV-2的7名个体从轻度到中度COVID-19疾病恢复后献血。提取的PBMC用SARS-COV-2肽库（15聚体与11重叠，覆盖刺突蛋白和核衣壳蛋白的S1和S2域； JPT肽）或T细胞特异性肽库（CMV，CEF延伸，CEFTA； Mabtech）作为阳性对照。使用IFN-γ/ IL-2 FluoroSpot分析（250,000个细胞/孔）在Mabtech IRIS上分析了T细胞反应。此外，使用内部开发的ELISA分析了SARS-CoV-2 Spike RBD特异的IgG。

结果

      刺激SARS-CoV-2肽后，所有COVID-19恢复期患者的Th1反应均为阳性。其中有6个人的SARS-CoV-2特异性IgG水平升高，但其中一名（C7）的IgG水平低于ELISA分析的阈值。有趣的是，如果仅通过抗体测试评估其COVID-19阴性，则该人的IFN-γ/ IL-2反应最强。

结论

      在这项研究中，抗体效价与T细胞反应之间的相关性似乎是相反的：抗体反应最低的三个个体（C4，C5和C7）具有最高的T细胞反应，在FluoroSpot分析中被检测为分泌IFN-γ/ IL-2的细胞数量最多。从目前的有限研究还不能得出是否显着相关的结论。同样，我们也没有与疾病严重程度相关的数据。但是，这些数据提出了有关COVID-19疾病期间T细胞和B细胞之间相互作用的重要问题。

Ni 等人 (Immunity, 2020) 最近发表的论文显示中和抗体效价与病毒特异性T细胞数量之间呈正相关，即暂时与我们的发现相反。这可以通过两个队列的有限大小或疾病严重程度的差异来解释。然而，在这篇文章中，一个恢复期的病人显示出无法检测到的抗体水平，确实有T细胞对病毒的反应，这是由我们的IFN-γ ELISpot分析所揭示的。

如上所述，我们展示了初步数据。与Cecil Czerkinsky (INSERM, CNRS, Université de la Côte d'Azur) 合作，正在进行类似和更大规模的研究，以评估该检测对COVID-19患者的诊断和预后价值。

2020-05-18更新

      我们刚刚启动了SARS-CoV-2 S1 S2 N定义的肽库。

      重要的是，肽池已通过FluoroSpot和ELISpot使用来自先前PCR确认为SARS-CoV-2阳性的COVID-19恢复期个体的PBMC进行了验证。

选择的肽基于Ahmed et al. (Viruses) 2020。作者描述了在T细胞分析中呈阳性的SARS-1表位，其中一些在SARS-1和SARS-2之间相同。 这些表位用于构建肽库。 41种肽（31种MHC-I肽和10种MHC-II肽，各25 µg）是由刺突蛋白（S1和S2域）和核蛋白（N）合成的肽。

SARS-CoV-2特异性记忆B细胞可用（反向）抗原特异性IgG荧光斑点检测

      目前对SARS-CoV-2特异性抗体的检测需求很大。几种不同的基于ELISA的测试已经启动或正在评估中。然而，随着时间的流逝，浆细胞主动分泌抗原特异性IgG。另一方面，记忆B细胞保持血液循环但不分泌抗体。因此，它们潜在的SARS-CoV-2特异性无法通过常见的血清学试验检测到。

本研究表明，反向抗原特异性荧光斑点法是检测人B细胞记忆反应的有效方法，可作为研究长期免疫的有益补充。

方法

      反向B细胞FluoroSpot：测定原理

      在循环中发现的B细胞通常不分泌抗体。抗原暴露后6～9天，可在血样中检测到抗体分泌浆细胞，但短时间后浆细胞迁移至骨髓，在血液循环中不再发现。因此，通常在血液样本中发现的是先前免疫的记忆B细胞。在清洗并转移到FluoroSpot或ELISpot板之前，需要在单独的试管或板中用R848 + IL-2多克隆预刺激记忆B细胞。到那时，记忆B细胞已经增殖为分泌抗体的浆细胞，并且可以检测其抗原特异性。

      研究记忆B细胞的有效方法是进行反向抗原特异性FluoroSpot分析。术语“反向”是指代替用抗原包被，而是将抗IgG mAb固定在板上。然后将预刺激和洗涤的细胞在平板中孵育18小时。在孵育过程中，所有分泌的IgG（无论特异性如何）均被抗IgG抗体捕获，随后-在细胞被洗掉后，将标记的目的抗原用作检测试剂，然后通过与荧光团结合的抗标签试剂将其显示出来。

      在本研究中，我们检测到对受体结合域（RBD）有反应性的IgG分泌B细胞，该区域是刺突蛋白S1域的一部分。FluoroSpot的多路复用能力允许并行测试针对其他几种SARS-CoV-2抗原的记忆B细胞。

RBD抗原的定义

SARS-CoV-2 Spike蛋白和核蛋白（N）在COVID-19恢复期个体中诱导抗体和T细胞应答。Spike蛋白分为N端结构域S1和C端结构域S2。与S2相比，S1域与其他冠状病毒的同源性较低，还含有受体结合结构域（RBD）。

在这项研究中，我们将我们的抗人IgG（MT91 / 145）捕获抗体固定在FluoroSpot板上。对于RBD特异性IgG的检测，我们使用带有C-末端Twin Strep tag®的RBD，随后用与550荧光团结合的Strep-Tactin®XT*检测。我们选择与RBD蛋白一起重组表达Twin-Strep-tag®，而不是传统的生物素化，因为赖氨酸的生物素化可能会干扰免疫原性表位。

结果

RBD反应性记忆B细胞的数目与抗体效价相关：记忆B细胞数目较高的个体在ELISA中也具有较高的抗体效价。

相对斑点体积（RSV）数据，即每个B细胞分泌的抗原特异性IgG的量和/或亲和力的测量值，也与ELISA结果相关。值得注意的是，尽管C1和C2的记忆B细胞数量相似，但C1的RSV值高5倍，推测这表明抗体对靶标的亲和力更高。

有趣的是，个体C7在ELISA分析中为阴性，但具有很强的T细胞反应（如上节所述），在这项研究中确实没有显示出可检测到的针对RBD的记忆B细胞。因此，我们在内部ELISA中验证了C7的特殊阴性结果：该个体只是没有任何B细胞分泌RBD特异性IgG。

我们在这里展示了一个PCR确认的COVID-19阳性个体（C7），尽管不动员任何RBD特异性IgG分泌B细胞，但仍能够抵抗病毒。很明显，这个人使用免疫系统的另一种方式进行了保护性免疫。

RBD特异性B细胞的数量与抗体效价相关
先前经PCR确认SARS-CoV-2的7名患者从轻度到中度COVID-19疾病恢复后献血。用R848和recIL-2刺激纯化的PBMC 96h。预刺激后将250 000个细胞/孔在抗IgG FluoroSpot板上孵育18小时。使用RBD-550偶联物检测RBD特异性IgG（请参阅测定原理）。对Mabtech IRIS ^TM进行了分析。顶部图显示了以斑点形成单位（SFU）衡量的IgG分泌细胞的频率，中间图显示了每个斑点的相对体积。此外，使用内部开发的ELISA对RBD特异的IgG进行了分析。

讨论区

      在开发疫苗时，此处显示的记忆B细胞和T细胞的数据类型可能很有价值：抗体效价可能不是判断免疫成功的唯一决定性因素。T细胞和抗体的亲和力对于理解候选疫苗的功效也可能非常重要。此外，即使抗体水平开始下降，B细胞FluoroSpot仍可能量化SARS-CoV-2特异性记忆B细胞。例如，对于疟疾，已证明抗体水平在原发感染后一年降至检测极限以下，而记忆B细胞水平保持恒定（Jahnmatz等人2020，提交的论文）。即使在没有抗体效价的情况下，检测SARS-CoV-2反应性的可能性对于理解COVID-19的长期免疫也将非常重要。

*本产品中包含的Strep-Tactin®XT蛋白由IBA GmbH生产，并提供给研究和商业市场使用。在商业市场上的使用仅限于拥有Twin-Strep-tag的商业使用许可证的公司。可从IBA GmbH，Rudolf-Wissell-Str获得有关Twin-Strep-tag商业使用许可证的信息。28，D-37079哥廷根。